鸟苷素家族是近年来发现的影响水盐代谢的激素，人类鸟苷素至少包括三种内源性多肽，鸟苷素(guanylin)、尿鸟苷素(uroguanylin)和淋巴鸟苷素(lymphoguanylin)。鸟苷素是最先发现的，它的发现来自对肠道细菌毒素受体的研究^{[1, 2]}。人鸟苷素前体蛋白由115个氨基酸组成，N-端为疏水信号肽区域，C-端为包含具有生物学功能的鸟苷素保守序列。鸟苷素前体蛋白需要进一步剪切其N-端的信号肽序列，形成没有功能的前体激素而稳定存在，前体激素在作用于靶细胞之前，由体内的蛋白酶切除N-端区域而释放C-端的活性肽段^[3]。鸟苷素是内源性大肠杆菌热稳定肠毒素（E. coli heat-stable enterotoxin,STa）受体的配体，是强大的内源性鸟苷酸环化酶C(guanylyl cyclase C, GC-C)激活物^{[4, 5]}。目前，对其研究集中在人类和鼠类上，而对其它动物的研究资料很少，本试验通过基因文库电子拼接及RT-PCR技术克隆了绵羊guanylin基因（包括ORF），并将序列提交GenBank收录(Accession EF654536)，   

为进一步研究羊鸟苷素基因的生物学功能提供理论基础。

取30d绵羊十二指肠黏膜组织，入液氮速冻，置-80℃保存。

AMV反转录酶、RNase-Inhibitor、Oligo (dT)、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、buffer、DNA Marker、pMD-19T载体、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coli JM109感受态细胞等均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；动物组织RNAout 购于绵阳高新区天泽基因工程有限公司。

1.3.1 引物利用牛guanylin推测序列（XM610296）对绵羊ESTs库进行搜索，获得2个 EST片断(EE766665、EE766848)，用SeqMan进行拼接，获得拼接体，根据拼接体序列分析，在5-UTR和3-UTR设计一对克隆引物，上游引物: 5’-GCCATGAACACCTTCCTGCTG-3’，下游引物: 5’-CCATCTGTTCTAGCACCCAGCAC-3’，预期片段341bp，引物由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。 

1.3.2 RNA的提取  分别取0.1g 十二指肠黏膜组织，采用动物组织RNAout提取总RNA，溶解于20µL DEPC 水中，-80℃保存备用。

1.3.3 RT-PCR扩增及纯化 RT体系：无RNA酶水6.5µL、dNTP Mix(2.5mM) 4µL、5×AMV Buffer 4µL、oligo d(T) 18(50pmol/L) 1µl、AMV（5u/µL）2µL、Ribonuclease Inhibitor (40U/µL) 0.5µl、Total RNA 2µl。反应程序：42℃ 60 min，72℃ 15 min，后冰浴2 min，得到cDNA，置冰箱4℃备用。

PCR体系：ddH₂O 15.3µL，10×Buffer(Mg²⁺) 2.5µL，dNTP Mix(2.5mM) 3µL, 25mM MgCL₂ 1.8µL，上、下游引物（20pmol/L）各0.5µL，cDNA 1µL，rTaq（5u/µL）0.4µL，总体积25µL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸 30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0进行纯化。

1.3.4克隆与测序将PCR扩增产物纯化后，与pMD-19T载体连接，构建克隆载体。转化到JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选，用菌落PCR鉴定，挑选出3管阳性菌液送TaKaRa宝生物（大连）有限公司完成测序。

1.3.5 序列分析  利用BioXM 2.6、DNAStar软件及在线运行Blast、Smart进行分析。

 

 

 

 

 

 

 

 

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到了长度为341bp的目的片段（图1）。菌落PCR鉴定得到同样大小的目的片段（图2）。

测序结果及推测的氨基酸序列如图3。克隆的绵羊guanylin基因包含一个完整的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,长为341bp，编码109个氨基酸，BioXM 2.6分析发现，其中酸性氨基酸为21个，碱性氨基酸为8个，分子量为11.66 KDa，等电点为4.26。

sheep     MNTFLLSALCLLGAWATLTGGVIVQDGDFSFSLESVKKLKDLQELQEP---RIPRNPVGP cattle    MNTFLLSALCLLGAWATLTGGVIVKDGDFSFSLESVKKLKDLQELQELQEPRIPRNPGGH           ************************:**********************    ****** * sheep     ITSNLCSLPTFPEELKPLCKEPNAQEILDRLGAIAADPSTCEICAYAACAGC cattle    IASNLCSLPTFPEELKPLCKESNAQEILDRLGAIAADPSTCEICAYAACAGC           *:*******************.******************************

图4 绵羊guanylin氨基酸序列与牛氨基酸序列的比较（注：信号肽下划线表示）

Fig.4. The comparation of guanylin amino acid sequences between sheep and cattle(the letters with underline are the putative signal peptide sequence)

 

sheep     MNTFLLSALCLLGAWATLTGGVIVQDGDFSFSLESVKKLKDLQELQEPRIPRN------P human     MNAFLLSALCLLGAWAALAGGVTVQDGNFSFSLESVKKLKDLQEPQEPRVGKLRNFAPIP           **:*************:*:*** ****:**************** ****: :       *   sheep     VGPITSNLCSLPTFPEELKPLCKEPNAQEILDRLGAIAADPSTCEICAYAACAGC human     GEPVVPILCSNPNFPEELKPLCKEPNAQEILQRLEEIAEDPGTCEICAYAACTGC             *:.. *** *.******************:** ** **.**********:**

图5 绵羊guanylin氨基酸序列与人氨基酸序列的比较（注：信号肽下划线表示）

Fig.5. The comparation of guanylin amino acid sequences between sheep and human(the letters with underline are the putative signal peptide sequence)

3.2 鸟苷素是鸟苷素家族成员之一，是Currie等运用生物检测技术从大鼠空肠中分离纯化得到的一个能特异结合鸟苷酸环化酶C（GC-C）或ST受体的小分子肽。鸟苷素的作用：能增强平滑肌运动，加强结肠转运；能激活氯离子通道，刺激Cl^－分泌；调节体内水的分布；增加肾组织中K⁺的排泄；具有内分泌和旁分泌的作用，通过cGMP 调节肠道的分泌和运动^[6-9]。Kuhn等研究发现有腹泻症状的良性结肠肿瘤病人循环血中鸟苷素的量较正常人高，血循环中升高的鸟苷素可能引起此类病人的腹泻^[10]，因此测定血液中的鸟苷素水平将对肠道肿瘤有潜在的诊断作用。因此对其进行研究具有重要的意义。目前，对其研究集中在人类和鼠类上，本研究为进行羊鸟苷素基因的体外表达及其生物学功能的研究提供理论基础。